جداسازی و تعیین خصوصیات لیپاز قلیا حرارت مقاوم از باکتری بومی enterobacter sp. و بهبود ویژگیهای هیدرولیزی آن با استفاده از روشهای مهندسی پروتئین

لیپازهای قلیاحرارت مقاوم در صنایع گوناگون کاربردهایی بسیاری دارند. در این مطالعه لیپاز قلیاحرات-مقاوم یک باکتری بومی enterobacter sp.bn12)) که از خاک پوششی مزارع پرورش قارچ خوراکی در اطراف تهران جداسازی شده، مورد بررسی قرار گرفت. ژن لیپاز (elbn12) از طریق کتابخانه ژنومی شناسایی گردید. بررسی قطعه بدست آمده از کتابخانه ژنومی، توالی کدکننده لیپازی را با وزن مولکولی پیش بینی شده kda 31 نشان داد. توالی پروتئینی لیپاز بدست آمده با لیپاز enterobacter sp.ag1 96% یکسانی داشت. لیپاز elbn12 به زیرخانواده i.1 لیپازهای باکتریایی تعلق دارد و جایگاه فعال آن از ser82، asp237 و his259 تشکیل شده است. لیپاز elbn12 در میزبان escherichia coli bl21 (de3) plyss تولید و سپس خالص سازی گردید. حداکثر فعالیت این لیپاز در?c 60 و درph 0/8 در حضور سوبسترای تری کاپریلین (c8) مشاهده شد و فعالیت ویژه آن در این شرایط u/mg 97/775±5106 بود ولی این لیپاز تنها 54% از فعالیت اولیه خود را پس از یک ساعت گرماگذاری در ?c 60 حفظ می کرد. به منظور افزایش پایداری حرارتی لیپاز elbn12، پنج جهش یافته از آن با جهش زایی در جایگاه های مشخص تهیه گردید. مطالعات بیوانفورماتیک و به دنبال آن بررسی های آزمایشگاهی برای بررسی اثر جهش ها انجام شد. تمامی این جهش یافته ها نیز در میزبان e. coli bl21 (de3) plyss تولید و سپس تخلیص شدند. دو جهش یافته k173a وq177a که از نظر موقعیت در سطح پروتئین قرار دارند، با افزایش پایداری حراراتی و همچنین فعالیت ویژه آنزیم همراه بودند. با این حال اعمال همزمان این دو جایگزینی در یک جهش یافته، اثر منفی در پایداری حرارتی داشت. جایگزینی اسیدهای آمینه هیدروفوب: ala و ile در جایگاه n106 که در فضای اتصال سوبسترا قرار دارد، با افزایش پایداری حرارتی همراه بود ولی فعالیت ویژه آنزیم را کاهش داد. بنابراین به نظر می رسد که آسپاراژین 106 برای ساختار یا عملکرد آنزیم ضروری است. لیپاز elbn12 و اکثر جهش یافته های آن در شرایط قلیایی پایدار بودند. این آنزیم ها پایداری خوبی را در حضور 50% (v/v) حلالهای آلی قطبی و غیرقطبی و همچنین در محلول 1% (w/v) دترجنت های غیریونی از خود نشان دادند. بعلاوه پایداری آنزیم های مورد بررسی در غلظت mm 10 یونهای فلزی به استثناء یونهای فلزات سنگین (zn2+ و fe3+) قابل توجه بود. edta هم در غلظت mm 10 تاثیر مهاری روی فعالیت هیچ یک از لیپازها نداشت. با نتایج بدست آمده می توان این طور نتیجه گیری کرد که جهش یافته های k173a و q177a از قابلیت های بیشتری برای استفاده در صنایع مختلف برخوردار هستند.